“家里有矿”的人如何做药物研发（第二季）

前情提要

美国蒙大拿大学的药物学家Andrea Stierle和Donald Stierle夫妇一直致力于研究特殊生境微生物的天然产物（点此观看第一季）。而离他们最近的特殊生境，莫过于也位于蒙大拿州的伯克利矿坑（Berkeley Pit）。这里原是一个露天铜矿，在1955至1982年间开采过，305米深的矿坑充满酸性水（pH值2.5），除了硫酸，水中还含有大量的铜、镉、砷等有毒元素。自1995年起，Stierle夫妇从这个相当于“自家后院”的特殊生境中采集了多种嗜酸、耐极端环境的微生物，并分离得到了多种结构和活性与众不同的化合物，研究成果频频在J. Org. Chem.、J. Nat. Prod.、Org. Lett.等期刊发表（下图）。伯克利矿坑从昔日的“毒矿坑”成为天然药物研发的“聚宝盆”。

图1. 部分来自伯克利矿坑微生物的天然产物

近几年，Stierle夫妇将关注点转移到微生物的共培养效应上。以往的研究更关注真菌和细菌的共培养，两种微生物通过交流（cross talk）能够激活沉默的基因簇并促进新颖的次级代谢产物形成。但是，不同真菌之间共培养产生次级代谢产物的研究报道还较少。2017年，他们从伯克利矿坑地表水中分离到两种极端嗜酸的真菌Penicillium camembertii/clavigerum和P. fuscum，他们将两者进行共培养，获得8个新结构16元环大环内酯Berkeleylactones A–H，其中，Berkeleylactone A表现出最强的抗菌活性，对4种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、炭疽杆菌、化脓性链球菌、白色念珠菌和光滑念珠菌的最低抑制浓度（MIC）为1-2 μg/mL。他们对Berkeleylactone A 的作用模式进行研究，结果表明，Berkeleylactone A 既不抑制蛋白质合成，也不以核糖体为作用靶点，显示了一种新的抗菌活性作用模式（J. Nat. Prod., 2017, 80, 1150–1160）。

图2. 共培养两种来自伯克利矿坑的真菌获得Berkeleylactones类化合物。图片来源：J. Nat. Prod.

正片开始

正如许多连续剧的剧情，这两株真菌共培养的故事还没有完结。最近，通过抗菌活性介导分离纯化，他们从这两株真菌共培养的氯仿提取物中获得一系列新结构的化合物Berkeleypenostatins。

他们通过高分辨质谱（HRESIMS）鉴定出化合物Berkeleypenostatin A（1）的分子量为C₂₉H₄₂O₁₀，一维和二维核磁数据显示化合物1含有β-D-葡萄糖片段、含双键的脂肪链、5/6/6三环和含内酯键的桥环结构。他们通过一维NOE、二维NOESY、COSY数据确定了化合物1的相对构型，并通过X射线晶体衍射确定了化合物1的绝对构型。

图3. 共培养两种来自伯克利矿坑的真菌获得Berkeleypenostatins类化合物。图片来源：J. Nat. Prod. 

他们通过高分辨质谱、一维和二维核磁图谱、以及相关数据与化合物1进行的比对，鉴定出化合物2和3的结构，分别命名为Berkeleypenostatin B和C。相比于Berkeleypenostatin A，Berkeleypenostatin B的C5位由羟基取代了β-D-葡萄糖，Berkeleypenostatin C的C7和C8位绝对构型与Berkeleypenostatin A相反，二者是差向异构体。

他们通过类似方法解析了化合物4的结构。结果显示，化合物4含有一个5/6/8三环结构，化合物4是从含化合物1的样品中分离得到的，且真空加热时容易降解。他们推测化合物4是化合物1通过Claisen重排之后的产物（图4)，命名为Berkeleypenostatin D。

图4. 推测的从Berkeleypenostatin A (1)到化合物4的Claisen重排。图片来源：J. Nat. Prod.

他们用类似的方法确定了化合物5-7的化学结构。结果显示，相比于化合物1-3，化合物5-7少了C3到C9位之间的内酯键，C3和C2位之间多了一个双键。化合物5和6是C5位β-D-葡萄糖取向不同的差向异构体。与化合物5、6相比，化合物7的C2位失去了羟基。化合物5-7分别命名为Berkeleypenostatin E-G。

他们对Berkeleypenostatin A-G进行抗菌活性测试，研究发现，Berkeleypenostatin E（5）显示最强的抗菌活性，对野生型、多重耐药性金黄色葡萄球菌菌株、炭疽菌株的最低抑制浓度（MIC）为4−9 μg/mL。在肿瘤细胞迁移抑制活性分析中，除化合物4以外的Berkeleypenostatins都显示了中度抑制作用，其中，Berkeleypenostatin E（5）的抑制作用最强。他们还对Berkeleypenostatin A和E进行了NCI（美国国家癌症研究所）60种人类肿瘤细胞系活性测试。结果显示Berkeleypenostatin E（5）的活性更强，对所有的白血病细胞系、多数结肠癌、黑色素瘤、肾癌和乳腺癌细胞系具有1–10 μM总生长抑制（TGI）作用。

图5. 共培养两种来自伯克利矿坑的真菌获得Berkeleypenostatins化合物。图片来源：J. Nat. Prod.

至此，Stierle夫妇通过共培养取自伯克利矿坑的极端嗜酸真菌Penicillium camembertii/clavigerum和P. fuscum 获得了Berkeleylactones和Berkeleypenostatins两个系列的新结构化合物，书写了伯克利矿坑天然产物的新篇章。传奇还在继续……

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Cryptic Biosynthesis of the Berkeleypenostatins from Coculture of Extremophilic Penicillium sp.

Andrea A. Stierle*, Donald B. Stierle, Daniel Decato, Jeremy Alverson, and Lily Apedaile

J. Nat. Prod., 2021, 84, 1656–1665, DOI: 10.1021/acs.jnatprod.1c00248

（本文由天生西南供稿）