大连化物所刘宇/张丽华Adv. Sci.：活细胞内聚集态蛋白质组的光催化邻近标记技术

蛋白质需要折叠成特定的三维结构才能行使其正确的生理功能。然而，在发生基因突变或长期应激条件下，蛋白质易发生错误折叠、聚集并最终形成难以降解的聚集态蛋白质。这一病理现象会导致诸如神经退行性疾病、代谢紊乱以及癌症等蛋白质构象疾病。目前，聚集态蛋白质的分析方法通常局限于对其位置、形貌以及聚集过程的成像示踪工具。然而，对于其中蛋白质的组成成分以及相互作用网络信息的解析方法鲜有报道。

近日，中国科学院大连化学物理研究所刘宇研究员（点击查看介绍）与张丽华研究员（点击查看介绍）团队合作，在前期聚集态蛋白质光催化原位交联技术（Angew. Chem. Int. Ed., 2023, 62, e202215215）基础上，通过筛选并优化有机小分子光敏催化剂结构，开发了可以选择性结合细胞内聚集态蛋白质组的靶向探针，实现其原位邻近标记和交联，并建立聚集态蛋白质组组分和互作网络分析新方法（AggID技术，图1）。

图1. AggID技术：细胞内聚集态蛋白质组光催化邻近标记和交联新方法。

在筛选传统有机小分子光敏剂结构对聚集态蛋白质的结合力实验中（图2A），作者团队发现玫瑰红（Rose Bengal, RB）对聚集态蛋白质具有极高的天然亲和力（图2B, 2C, 2D），并且这种高亲和力广泛的适用于包括无定型和淀粉样变聚集态蛋白质（图2E）。为了探索该分子结合聚集态蛋白质的机制，作者选用了玫瑰红荧光团（氧杂蒽，xanthene）为母体，对比其多种卤素衍生物与聚集态蛋白质的结合力，发现了分子疏水常数（cLogP）的重要作用（图2F, 2G）。该团队猜测，这可能是由于蛋白质在聚集的过程中伴随着氨基酸疏水基团外翻，导致其内部形成疏水空腔，易与疏水分子结合。

图2. 传统有机荧光团/光敏剂对聚集态蛋白质结合能力的评估。（A）常见的有机荧光团/光敏剂；（B）有机小分子结合聚集态蛋白质性能评估实验流程图；（C）&（D）玫瑰红对聚集态蛋白质具有极高的天然结合力；（E）玫瑰红对聚集态蛋白质的高结合力广泛适用于多种类型的聚集态蛋白质；（F）基于氧杂蒽结构的光敏剂及其疏水常数；（G）基于氧杂蒽结构的有机小分子对不同聚集态蛋白质结合能力的对比。

由于玫瑰红分子对于聚集态蛋白质优异的天然结合力以及其自身的光敏性能，作者团队认为该分子可应用于聚集态蛋白质的光催化邻近标记和交联（图3A）。在光激活和炔丙胺（PA）作为标记底物的条件下，玫瑰红实现了聚集态蛋白质的高效标记（图3B）。延长光照时间，该分子可以实现对聚集态蛋白质的光交联（图3C）。该分子可广泛标记不同类型的聚集态蛋白质体系（图3D）。

图3. 玫瑰红可以实现对聚集态蛋白质的邻近标记和交联。（A）玫瑰红对于聚集态蛋白质邻近标记和交联作用的示意图；（B）光照条件下，玫瑰红可以实现聚集态蛋白质的高效炔丙胺标记；（C）随着光照时间的延长，玫瑰红可以引发聚集态蛋白质的光交联；（D）玫瑰红对聚集态蛋白质的标记和交联适用于多种聚集态蛋白质体系。

作者进一步的鉴定了光催化标记的化学选择性。选用多种聚集态蛋白质作为研究模型，作者通过串联质谱分析，鉴定出三种蛋白质的标记位点（图4A）。结果发现甲硫氨酸、赖氨酸和半胱氨酸是最容易被标记的氨基酸残基（图4B）。通过分析标记位点所在肽段的亲水性指数（GRAVY），团队发现三种蛋白质的标记位点均在蛋白质的疏水区域（图4C），以上结果进一步证明了玫瑰红分子是通过其较高的疏水性实现对聚集态蛋白质的选择性结合和光敏标记。

图4. 聚集态蛋白质的光催化标记位点鉴定。（A）聚集态WT-DHFR，TAU-K18和WT-TTR的标记位点鉴定；（B）聚集态WT-DHFR，TAU-K18和WT-TTR的标记位点统计学分析；（C）聚集态WT-DHFR，TAU-K18和WT-TTR的标记位点所在肽段的亲水性指数分析。

作者进一步对该分子进行酯化修饰，赋予其透膜性质，并应用于活细胞内的聚集态蛋白质组的组分鉴定和互作网络分析（图5A）。在药物应激的细胞中，P8探针可选择性结合胞内聚集态蛋白质组，实现光催化原位邻近标记和互作交联。作者利用蛋白质组学分析方法鉴定到大量与蛋白质稳态网络相关的蛋白质发生错误折叠和聚集（图5B，5C）。其中，标记位点最多的蛋白质为HSPA1B（HSP70, 图5D）。以HSPA1B为中心，作者分析了其互作网络并发现，在硼替佐米（Bortezomib）作用下，HeLa细胞通过分子伴侣介导的自噬途径实现聚集态蛋白质的降解，而非蛋白酶体-泛素化途径（图5E, 5F）。自噬降解通路中关键蛋白质p62的验证实验也印证了这一观点（图5G）。

图5. 基于P8分子的邻近标记策略实现对细胞内聚集态蛋白质组的组分分析和互作网络鉴定。（A）P8鉴定细胞内蛋白质组组分及互作网络流程示意图；（B）&（C）细胞内聚集态蛋白质组组分及功能分析；（D）细胞内标记效率最高蛋白质的标记位点分析；（E）HSPA1B互作网络分析及（F）聚集态蛋白质降解通路推断；（G）自噬降解通路验证。

这一成果近期发表于Advanced Science 期刊上。文章的通讯作者是中国科学院大连化学物理研究所刘宇研究员和张丽华研究员。中国科学院大连化学物理研究所赵群研究员为该工作的蛋白质组学和互作网络分析提供了技术支持。西湖大学张鑫教授为该工作提供了细胞成像数据。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A Cell-Permeable Photosensitizer for Selective Proximity Labeling and Crosslinking of Aggregated Proteome

Huan Feng, Qun Zhao, Nan Zhao, Zhen Liang, Yanan Huang, Xin Zhang, Lihua Zhang,* and Yu Liu*

Adv. Sci., 2024, DOI: 10.1002/advs.202306950

导师介绍

张丽华

https://www.x-mol.com/university/faculty/22784 

刘宇

https://www.x-mol.com/groups/DICP--liu_yu