四川大学李峰课题组JACS：用于可逆、连续控制DNA链置换动力学的即插即用模块

细胞作为微型工厂，通过使用化学反应网络（Chemical Reaction Networks, CRNs）对内部分子机器进行操作和控制。众多调节模块和信号通路对CRN进行精确的时间控制，这些组件在维持细胞功能和体内平衡中发挥着重要作用。系统化学和合成生物学领域的新兴目标之一是创造具有时间上高度可控的类生命材料和CRN。目前已经实现了几种基于DNA的合成非平衡系统，包括DNA计时器电路、DNA振荡器、和基于DNA的耗散CRN。从更大的范围上来说，精确的时间控制对于生物计算、生物传感、生物成像和治疗等至关重要。

从根本上讲，CRN的时间控制依赖于每个基本构件的化学动力学的精确调节。在动态DNA纳米技术中，立足点介导的链置换反应（Toehold-Mediated Strand Displacement, TMSD）是功能强大且被广泛应用的基元反应之一，是构建动态和耗散DNA化学反应网络的重要模块。因此，TMSD动力学的精准调控一直是动态DNA纳米技术的研究重点。到目前为止TMSD的调控策略一般依赖于复杂的反应设计，这不仅增加了反应体系信号泄露的风险而且设计路线一旦定型难以实时变更，严重限制了复杂反应网络的构建与应用。

近日，四川大学李峰教授（点击查看介绍）课题组开发了一个即插即用的DNA链置换反应动力学调节模块anti-toehold，实现了对TMSD动力学可逆和连续的控制。这一调控模块具有多重优势：（1）anti-toehold模块独立于TMSD反应体系，不仅能够轻松灵活地集成到目标CRN中，更重要的是实现了序列信息的互不干扰而最大程度地减少信号泄露；（2）该模块能够快速地实现可逆调控，可以动态实时地激活和停用；（3）能够通过简单的浓度调控实现动力学精细且连续的调节。

图1. 基于Anti-toehold调节的DNA链置换反应原理图

设计原理：Anti-toehold通过占据双链底物的立足点域形成亚稳态的CPAt三链复合物来实现对动力学的调控。由于立足点对接通常是TMSD的限速步骤，阻断立足点域可以有效改变TMSD的动力学。Anti-toehold的设计同时考虑了碱基配对和碱基堆积，以在anti-toehold和CP之间提供足够的亲和力，形成亚稳态复合物。通过在双链底物的结构域a*和b*之间引入1个碱基堆叠位点有效地将TMSD反应速率Vmax从3.3 × 10⁻¹¹降低到4.2 × 10⁻¹³ M/s。将anti-toehold设计为茎环结构引入第二个碱基堆叠位点，Vmax进一步降低到1.4×10⁻¹³ M/s。除了碱基堆积位点的数量外，碱基堆积的类型也用于调整TMSD的动力学，在相同的实验条件下，A-A堆叠的效率是C-A（或T-A）堆叠的四倍。

理论框架：作者在toehold occlusion反应模型的基础上进行了修改，建立了新的反应模型对潜在的反应路径进行探究。整个反应从形成CPAt三链复合物开始，由于CPAt是亚稳态的，因此CPAt和CP、anti-toehold之间存在解离平衡。加入入侵者T后，随后的链位移有两种可能的途径：T和CP之间的相互作用和T和CPAt之间的直接置换。模拟结果证明，这两种反应路径，对实现模拟动力学曲线和实验结果之间的最佳拟合非常必要。

图2. Anti-toehold调控的TMSD热力学模拟

综上，anti-toehold是对当前DNA链置换技术工具箱的全新补充。作为该工具应用前景的展示，作者仅通过引入anti-toehold模块便成功地将单调增长的TMSD反应信号重新编程为具有连续调节能力的脉冲信号；此外还提供了一种设计连续可调DNA杂交探针的新策略，为解决临床上重要的单碱基突变识别问题提供了新的设计工具。

该工作近日发表于Journal of the American Chemical Society 期刊。四川大学李峰教授为通讯作者，化学学院硕士研究生吴浪和专职博士后王冠为共同第一作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Plug-and-Play Module for Reversible and Continuous Control of DNA Strand Displacement Kinetics

Lang Wu, Guan A. Wang, and Feng Li*

J. Am. Chem. Soc., 2024, 146, 6516–6521, DOI: 10.1021/jacs.3c09242

李峰教授简介

李峰 四川大学化学学院教授，加拿大布鲁克大学化学系兼职教授，入选国家高层次人才计划青年项目及四川省特聘专家。2013年于加拿大阿尔伯塔大学（University of Alberta）获得博士学位，师从加拿大皇家科学院院士乐晓春教授， 2014-2019年任加拿大布鲁克大学（Brock University）助理教授、终身制副教授。2019年7月起全职回国，主要从事分析化学与临床检验医学的交叉研究，任中国人体健康促进会临床检验科学技术转化专业委员会委员。在J. Am. Chem. Soc.、Nat. Commun.、 Angew. Chem. Int. Ed.、Anal. Chem.等国际高水平期刊发表学术论文90余篇，引用5500余次，申请国内国际发明专利10余项，获授权3项，转化2项。主要荣誉包括加拿大化学会Fred Beamish Award、加拿大安大略青年科学家奖、布鲁克大学终身教职、四川大学好未来学者奖等。课题组网站：https://adnlab.mysxl.cn/  。

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