▼ 《中国药典》生物制品HCD限度
宿主残留DNA检测目的与方法
理想的定量检测方法其灵敏度应能检测到约10pg/剂量的残留DNA。杂交法、基于DNA结合蛋白的免疫色谱法(阈值法)和定量PCR方法因灵敏度均可达到检测要求,都属于经典方法。
▼ 宿主细胞残留DNA检测方法
《美国药典》和《欧洲药典》将高灵敏度、高特异性的qPCR法和非序列特异性的DNA结合蛋白法作为残留DNA检测的推荐方法;《中国药典》则收录了特异性高的定量PCR法和半定量的DNA探针杂交法以及非序列特异性的荧光染色法。然而,非特异性的DNA检测结果不能区分究竟是生产过程污染、检测造成的假阳性污染还是工艺缺陷引起的DNA残余,存在检测局限性。
影响残留核酸qPCR检测的因素
对qPCR检测方法来说,以下因素对其检测结果准确性和方法灵敏度存在较大影响:
qPCR引物探针的序列特异性
为保证方法高灵敏度和检出率,用于qPCR检测的特异序列必须是存在于高度保守区域内的稳定序列,并且需要散布在基因组上,保证不会因工艺导致的残留偏好而引起漏检。
参考品DNA量值溯源及质量保证
参考品DNA的量值准确与否,直接关系到样品检测结果的准确性,因此需制定完善的参考品量值溯源程序,确保结果准确可靠。参考品DNA的质量要求可从条带大小、完整性、纯度、浓度等方面做全面评估,细胞来源的参考品应考察支原体污染,质粒参考品应考察质粒宿主E.coli基因组DNA残留情况等,尽量排除干扰确保结果准确可靠。
前处理过程杂质干扰的去除
样品的前处理操作步骤对DNA检测结果的准确度影响较大,通常采用加样回收试验来进行验证并确定可接受的偏离限度,内标回收率在50-150%的范围内都可以接受。样品提取步骤较为复杂,需要特别注意,操作不当不但可能影响回收率还可能引入环境污染。
qPCR实验室能力验证
为满足检测要求,应对实验室硬件和软件能力进行确认。实验室设计应按实验流程分区操作,每个操作区域配置相应设施、设备及耗材,建立实验室质量管理体系,考核实验人员的操作能力及数据分析解读能力等。