The underlying mechanisms by which probiotic lactic acid bacteria (LAB) enhance the health of the consumer have not been fully elucidated. Verification of probiotic modes of action can be achieved by using single- or multiple-gene knockout analyses of bacterial mutants in in vitro or in vivo models. We developed a novel system based on an inducible toxin counter-selection system, allowing for rapid and efficient isolation of LAB integration or deletion mutants. The Lactococcus lactis nisin A inducible promoter was used for expression of the Escherichia coli mazF toxin gene as counter-selectable marker. The flippase (FLP)/flippase recognition target (FRT) recombination system and an antisense RNA transcript were used to create markerless chromosomal gene integrations/deletions in LAB. Expression of NisR and NisK signalling proteins generated stable DNA integrations and deletions. Large sequences could be inserted or deleted in a series of steps, as demonstrated by insertion of the firefly bioluminescence gene and erythromycin resistance marker into the bacteriocin operons or adhesion genes of Lactobacillus plantarum 423 and Enterococcus mundtii ST4SA. The system was useful in the construction of L. plantarum 423 and E. mundtii ST4SA bacteriocin and adhesion gene mutants. This provides the unique opportunity to study the role of specific probiotic LAB genes in complex environments using reverse genetics analysis. Although this work focuses on two probiotic LAB strains, L. plantarum 423 and E. mundtii ST4SA, the system developed could be adapted to most, if not all, LAB species.

中文翻译：

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开发用于乳酸菌中染色体基因整合和缺失的新型选择/对选择系统。

益生菌乳酸菌（LAB）增强消费者健康的基本机制尚未完全阐明。益生菌作用方式的验证可以通过在体外或体内模型中使用细菌突变体的单基因或多基因敲除分析来实现。我们开发了一种基于可诱导毒素反选择系统的新型系统，可快速有效地分离LAB整合或缺失突变体。乳酸乳球菌乳酸链球菌素A诱导型启动子用于表达大肠杆菌mazF毒素基因作为反选择标记。使用flippase（FLP）/ flippase识别靶标（FRT）重组系统和反义RNA转录本可在LAB中创建无标记染色体基因整合/缺失。NisR和NisK信号蛋白的表达产生稳定的DNA整合和缺失。可以通过一系列步骤插入或删除大序列，如萤火虫生物发光基因和红霉素抗性标记插入植物乳杆菌423和芒氏肠球菌ST4SA的细菌素操纵子或粘附基因所证明的。该系统可用于构建植物乳杆菌423和芒氏肠杆菌ST4SA细菌素和粘附基因突变体。这提供了独特的机会，可以使用反向遗传学分析来研究特定益生菌LAB基因在复杂环境中的作用。尽管这项工作的重点是两种益生菌LAB菌株，即L. plantarum 423和E. mundtii ST4SA，但开发的系统可以适应大多数（如果不是全部）LAB物种。可以通过一系列步骤插入或删除大序列，如萤火虫生物发光基因和红霉素抗性标记插入植物乳杆菌423和芒氏肠球菌ST4SA的细菌素操纵子或粘附基因所证明的。该系统可用于构建植物乳杆菌423和芒氏肠杆菌ST4SA细菌素和粘附基因突变体。这提供了独特的机会，可以使用反向遗传学分析来研究特定益生菌LAB基因在复杂环境中的作用。尽管这项工作的重点是两种益生菌LAB菌株，即L. plantarum 423和E. mundtii ST4SA，但开发的系统可以适应大多数（如果不是全部）LAB物种。可以通过一系列步骤插入或删除大序列，如萤火虫生物发光基因和红霉素抗性标记插入植物乳杆菌423和芒氏肠球菌ST4SA的细菌素操纵子或粘附基因所证明的。该系统可用于构建植物乳杆菌423和芒氏肠杆菌ST4SA细菌素和粘附基因突变体。这提供了独特的机会，可以使用反向遗传学分析来研究特定益生菌LAB基因在复杂环境中的作用。尽管这项工作的重点是两种益生菌LAB菌株，即L. plantarum 423和E. mundtii ST4SA，但开发的系统可以适应大多数（如果不是全部）LAB物种。如通过将萤火虫生物发光基因和红霉素抗性标记物插入植物乳杆菌423和芒氏肠球菌ST4SA的细菌素操纵子或粘附基因所证明的。该系统可用于构建植物乳杆菌423和芒氏肠杆菌ST4SA细菌素和粘附基因突变体。这提供了独特的机会，可以使用反向遗传学分析来研究特定益生菌LAB基因在复杂环境中的作用。尽管这项工作的重点是两种益生菌LAB菌株，即L. plantarum 423和E. mundtii ST4SA，但开发的系统可以适应大多数（如果不是全部）LAB物种。如通过将萤火虫生物发光基因和红霉素抗性标记物插入植物乳杆菌423和芒氏肠球菌ST4SA的细菌素操纵子或粘附基因所证明的。该系统可用于构建植物乳杆菌423和芒氏肠杆菌ST4SA细菌素和粘附基因突变体。这提供了独特的机会，可以使用反向遗传学分析来研究特定益生菌LAB基因在复杂环境中的作用。尽管这项工作的重点是两种益生菌LAB菌株，即L. plantarum 423和E. mundtii ST4SA，但开发的系统可以适应大多数（如果不是全部）LAB物种。mundtii ST4SA细菌素和粘附基因突变体。这提供了独特的机会，可以使用反向遗传学分析来研究特定益生菌LAB基因在复杂环境中的作用。尽管这项工作的重点是两种益生菌LAB菌株，即L. plantarum 423和E. mundtii ST4SA，但开发的系统可以适应大多数（如果不是全部）LAB物种。mundtii ST4SA细菌素和粘附基因突变体。这提供了独特的机会，可以使用反向遗传学分析来研究特定益生菌LAB基因在复杂环境中的作用。尽管这项工作的重点是两种益生菌LAB菌株，即L. plantarum 423和E. mundtii ST4SA，但开发的系统可以适应大多数（如果不是全部）LAB物种。