Our previous study on the binding activity between Cel5H and clay minerals showed highest binding efficiency among other cellulase enzymes cloned. Here, based on previous studies, we hypothesized that the positive amino acids on the surface of Cel5H protein may play an important role in binding to clay surfaces. To examine this, protein sequences of Bacillus licheniformis Cel5H (BlCel5H) and Paenibacillus polymyxa Cel5A (PpCel5A) were analyzed and then selected amino acids were mutated. These mutated proteins were investigated for binding activity and force measurement via atomic force microscopy (AFM). A total of seven amino acids which are only present in BlCel5H but not in PpCel5A were selected for mutational studies and the positive residues which are present in both were omitted. Of the seven selected surface lysine residues, only three mutants K196A(M2), K54A(M3) and K157T(M4) showed 12%, 7% and 8% less clay mineral binding ability, respectively compared with wild-type. The probable reason why other mutants did not show altered binding efficiency might be due to relative location of amino acids on the protein surface. Meanwhile, measurement of adhesion forces on mica sheets showed a well-defined maximum at 69 ± 19 pN for wild-type, 58 ± 19 pN for M2, 53 ± 19 pN for M3, and 49 ± 19 pN for M4 proteins. Hence, our results demonstrated that relative location of surface amino acids of Cel5H protein especially positive charged amino acids are important in the process of clay mineral-protein binding interaction through electrostatic exchange of charges.

中文翻译：

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Cel5H 蛋白表面氨基酸在与粘土矿物结合中的作用及其力的测量

我们之前对 Cel5H 和粘土矿物之间结合活性的研究表明，在克隆的其他纤维素酶中，结合效率最高。在这里，基于先前的研究，我们假设 Cel5H 蛋白表面的阳性氨基酸可能在与粘土表面的结合中起重要作用。为了检查这一点，分析了地衣芽孢杆菌 Cel5H (BlCel5H) 和多粘类芽孢杆菌 Cel5A (PpCel5A) 的蛋白质序列，然后对选定的氨基酸进行了突变。通过原子力显微镜 (AFM) 研究这些突变蛋白的结合活性和力测量。总共选择了仅存在于 BlCel5H 中而不存在于 PpCel5A 中的七个氨基酸用于突变研究，并且省略了存在于两者中的阳性残基。在七个选定的表面赖氨酸残基中，与野生型相比，只有三个突变体 K196A(M2)、K54A(M3) 和 K157T(M4) 的粘土矿物结合能力分别降低了 12%、7% 和 8%。其他突变体没有显示出改变的结合效率的可能原因可能是由于氨基酸在蛋白质表面上的相对位置。同时，对云母片上粘附力的测量显示，野生型蛋白的最大值为 69 ± 19 pN，M2 为 58 ± 19 pN，M3 为 53 ± 19 pN，M4 蛋白为 49 ± 19 pN。因此，我们的结果表明，Cel5H 蛋白表面氨基酸的相对位置，尤其是带正电荷的氨基酸，在通过静电电荷交换的粘土矿物-蛋白质结合相互作用过程中很重要。分别与野生型比较。其他突变体没有显示出改变的结合效率的可能原因可能是由于氨基酸在蛋白质表面上的相对位置。同时，对云母片上粘附力的测量显示，野生型蛋白的最大值为 69 ± 19 pN，M2 为 58 ± 19 pN，M3 为 53 ± 19 pN，M4 蛋白为 49 ± 19 pN。因此，我们的结果表明，Cel5H 蛋白表面氨基酸的相对位置，尤其是带正电荷的氨基酸，在通过静电电荷交换的粘土矿物-蛋白质结合相互作用过程中很重要。分别与野生型比较。其他突变体没有显示出改变的结合效率的可能原因可能是由于氨基酸在蛋白质表面上的相对位置。同时，对云母片上粘附力的测量显示，野生型蛋白的最大值为 69 ± 19 pN，M2 为 58 ± 19 pN，M3 为 53 ± 19 pN，M4 蛋白为 49 ± 19 pN。因此，我们的结果表明，Cel5H 蛋白表面氨基酸的相对位置，尤其是带正电荷的氨基酸，在通过静电电荷交换的粘土矿物-蛋白质结合相互作用过程中很重要。对云母片上粘附力的测量显示，野生型蛋白的最大值为 69 ± 19 pN，M2 为 58 ± 19 pN，M3 为 53 ± 19 pN，M4 蛋白为 49 ± 19 pN。因此，我们的结果表明，Cel5H 蛋白表面氨基酸的相对位置，尤其是带正电荷的氨基酸，在通过静电电荷交换的粘土矿物-蛋白质结合相互作用过程中很重要。对云母片上粘附力的测量显示，野生型蛋白的最大值为 69 ± 19 pN，M2 为 58 ± 19 pN，M3 为 53 ± 19 pN，M4 蛋白为 49 ± 19 pN。因此，我们的结果表明，Cel5H 蛋白表面氨基酸的相对位置，尤其是带正电荷的氨基酸，在通过静电电荷交换的粘土矿物-蛋白质结合相互作用过程中很重要。